ヴォルデモート卿の復活が公のものとなり、魔法界は第二次魔法戦争の暗い影に覆われ始める。アルバス・ダンブルドア校長は、ダーズリー家の元からハリー・ポッターを迎えに来ると、旧知のホラス・スラグホーンをホグワーツの新しい魔法薬学の教授として復職させるためにハリーを同行させる。その結果、長年この職を望んでいたセブルス・スネイプが、ついに念願の「闇の魔術に対する防衛術」の教授に就任することとなった。 ハリーはスラグホーンの授業で、「半純血のプリンス」と署名された古い魔法薬学の教科書を手に入れる。その教科書には、元の所有者による優れた手書きの注釈がびっしりと書き込まれており、ハリーは一夜にして魔法薬学の天才と見なされるようになる。 時を同じくして、ダンブルドアはハリーに個人授業を始める。校長室の憂いの篩を使い、トム・マールヴォロ・リドル（後のヴォルデモート卿）の過去に関する記憶を二人で旅することで、彼の不死の秘密と弱点を探ろうとする。しかし、最も重要な記憶の一つである、スラグホーンがトム・リドルに「分霊箱」について語った記憶が改竄されていた。ハリーに課された最大の使命は、スラグホーンを説得し、この完全な記憶を引き出すことだった。 物語は、ハリーがドラコ・マルフォイの不審な行動を執拗に追い、彼が死喰い人として何らかの任務を遂行していると確信する様子や、ロン・ウィーズリー、ハーマイオニー・グレンジャー、そしてジニー・ウィーズリーとの間で繰り広げられる恋愛模様を交えながら進行する。 クライマックスでは、ハリーは「幸運の液体」の助けを借りてスラグホーンから本物の記憶を入手し、ヴォルデモート卿が自らの魂を7つに分割する「分霊箱」を複数作成したことを知る。ダンブルドアは分霊箱の一つを発見したと信じ、ハリーを伴って危険な洞窟へ向かう。多大な犠牲を払ってスリザリンのロケットを手に入れるが、ホグワーツへ戻ると城は死喰い人の侵入を受け、天文台の塔でドラコ・マルフォイと対峙する。ドラコはダンブルドアを殺害する任務を遂行できずにいたが、そこに現れたセブルス・スネイプが「アバダ・ケダブラ」の呪文でダンブルドアの命を奪った。 逃亡するスネイプを追うハリーに対し、スネイプは自らが「半純血のプリンス」であることを明かす。物語は、洞窟で手に入れたロケットが偽物であり、「R.A.B.」と署名された謎の人物によって本物は持ち去られていたことが判明するという衝撃の事実と共に幕を閉じる。ダンブルドアの葬儀の後、ハリーはホグワーツには戻らず、残りの分霊箱を探し出し破壊する旅に出ることを決意する。
物語のタイトル「半純血のプリンス」 (The Half-Blood Prince) は、セブルス・スネイプの自称である。
この名前は、スネイプがホグワーツ在学中に、自身の出自と優れた魔法の才能を組み合わせ、誇りと皮肉を込めて自らを呼んだものである。彼が教科書に書き記した独自の呪文（セクタムセンプラなど）や魔法薬学の改良法は、彼の類稀なる才能を証明している。